4、从单个克隆菌团中挑选，并将其放置于预先标记好的液体培养基中，每个培养基放置一个菌落。

5、在37℃、180rpm的条件下，进行振荡培养过夜。

二、收获细菌并裂解

1、将经离心扩增处理的良好菌液，按照说明书指引进行重悬，并转移至1.5毫升的离心管中。

2、利用质粒小量抽提试剂盒，按照说明书的规定进行质粒提取操作。

3、将细菌进行高速离心1分钟，以完全清除上清液。

4、加入250微升的RB溶液，通过振荡器充分悬浮细菌。

5、加入250微升的LB溶液，迅速上下颠倒10次，促使细菌裂解，然后在室温下静置2分钟。

6、加入250微升的NB溶液，立即上下颠倒10次，确保充分中和，在室温下静置2分钟。

7、在室温下，以1500rpm的高速进行离心，时长为15分钟。

8、将吸附柱置于收集管内，将离心得到的上清转移至吸附柱，室温下以15000rpm的高速进行离心，持续30秒。

9、弃去废液后，将吸附柱放入收集管，向吸附柱中加入700微升的WB溶液，再次以15000rpm的高速进行离心，持续30秒。

10、重复上述步骤一次。

11、将吸附柱放入干净的1.5毫升离心管中，添加30-50微升预热的Elution Buffer，室温下放置2分钟，然后以高速离心1分钟。

12、对样品进行电泳检测：使用1%琼脂糖凝胶电泳，上样量为2微升，在紫外灯下观察，最亮的带表示超螺旋形态，可一定程度上反映质粒提取的纯度。

三、质粒的纯化

1、取先前提取的质粒，置于1.5毫升的离心管中，并加入其1/10体积的3mol/L无菌乙酸钠溶液。

2、添加2倍体积的无水乙醇，将混合物放置于-20℃冷冻4-6小时或过夜。

3、在4℃下，使用高速离心机以14000rpm进行离心，持续20分钟。

4、弃去上清液，使用70%乙醇进行两次洗涤。

5、空气干燥，可将样品放于超净工作台中晾干。

6、加入200微升的无菌水溶液，使沉淀溶解，即可得到质粒溶液。

7、使用紫外分光光度计测量质粒的浓度和产量。

测量OD260和OD280的值：质粒DNA浓度=OD260×50×稀释倍数（μg/mL）。

提取方法

质粒DNA的提取方法主要有碱裂解法、煮沸法、酚氯 仿裂解法。跟据不同的实验目的和仪器设备择取不同的实验方案。

实验流程

一、实验方法及原理：（碱裂解法）

碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。碱性使质粒DNA变性，再将pH值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA，而染色体DNA不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去。

二、实验材料、试剂、仪器：

大肠杆菌、Tris-Hcl、EDTA、葡萄糖、NaOH、KAac、NaAc、异丙醇、溶菌酶、酚:氯 仿、无水乙醇、LB培养基、超净工作台、培养箱、摇床、恒温水浴锅、台式离心机、取液器、低温冰箱、冷冻真空干燥机、电泳仪、水平电泳槽、紫外观测仪。

三、实验步骤：

1、细菌繁殖：LB培养基，2 ml/20 ml，37℃，200 rpm，摇一摇，过夜。

2、离心10 min，5 000 rpm， 4℃；弃上淸液。

3、沉淀（菌体细胞）预冷的TES缓冲液洗涤，离心10 min，5 000 rpm， 4℃，加入预冷的1 ml Solution I，冰浴10 min。

4、重新悬浮，加入150 ul溶菌酶母液，室温放置5 min。

5、加入1.2 ml Solution II， 冰浴5 min。

6、加入0.9 ml预冷乙酸钾，混匀，离心10 min，12 000 rpm，4℃。

7、加入1.5 ml异丙醇，-20℃冰箱内放置15 min。

8、离心10 min，12 000 rpm，4℃。

9、取沉淀，悬于400 ul TE缓冲液中。

10、加入40 ul，3 M NaAc。

11、酚/氯 仿，抽提，乙醇沉淀。

12、离心10 min，12 000 rpm，4℃。

13、取沉淀，冷冻干燥，再悬浮于50 ul TE缓冲液中。

14、电泳检测提取DNA的质量。

常见问题

一、质粒提取的得率低或无质粒

1、菌体老化情况：重新进行筛选，并挑选年轻的菌落用于液体培养。

2、质粒拷贝数较低：选择高拷贝的新菌体进行筛选。

3、碱裂解效果不足：若收集的菌体含量较高，可根据需要适度增加碱裂解液的1、2、3号成分的含量。

4、乙醇残留或漂洗不彻底：确保充分清除乙醇残留，加强漂洗步骤。

5、洗脱处理不妥：调整洗脱液的添加量，避免加入过多或洗脱时间过短。

二、质粒的纯化不足

1、混有RNA，RNase A处理不彻底。

2、混有基因组DNA。避免加入溶液2，3时剧烈震荡。如果加入溶液P2后过于粘稠，无法温和混匀，请减少菌体用量。细菌培养时间过长也会导致细胞和DNA的降解。