01简介
随着分子生物学和细胞生物学的不断发展，细胞转染已经成为研究真核细胞基因功能的主要手段之一，广泛应用于基因功能解析、表达调控、突变分析以及蛋白质生产等领域。
细胞转染是将外源遗传物质（如DNA或RNA）导入真核细胞的技术。这种技术通常可分为两大类：瞬时转染和稳定转染。
瞬时转染是指外源DNA/RNA未整合到宿主染色体，导致宿主细胞内存在多个拷贝数，从而实现高水平表达。但是，这种高水平表达只能持续数天。使用超螺旋质粒DNA进行瞬时转染效率最高，因为这种DNA能够被细胞更有效地摄取。
稳定转染则是将外源DNA整合到细胞基因组中，或者将其存在于游离型质粒中，并且可以传递至转染细胞的子代。通常情况下，只有少数外源DNA拷贝能够整合到稳定转染基因组中，导致稳定转染基因的表达水平较瞬时转染低。鉴于外源DNA整合到基因组的概率较低，常常在转染的DNA构建中加入可筛选标记物，例如产生药物抗性的基因或对缺陷细胞系进行补偿的必需基因，然后在短暂恢复期后施加适当的筛选压力。
02转染方式
化学方法利用特定的载体分子包被核酸，使其带有中性电荷或正电荷，例如阳离子脂质体转染法、磷酸钙共沉淀法等。
生物方法则是利用基因工程病毒将非病毒基因转染到细胞中，常见的方法是通过病毒感染实现。
物理方法则通过在细胞膜表面生成一个短暂的孔来导入DNA，典型的例子是电穿孔法。
03实验方法
以脂质体转染法为例：
原理：脂质体转染法利用带有正电荷的阳离子脂质体与DNA的磷酸根通过静电作用结合，形成DNA-脂质体复合物。这些复合物能够被带有负电荷的细胞膜吸附，并通过融合或细胞内吞作用进入细胞。脂质体转染适用于悬浮或贴壁培养的细胞，是实验室中最常用的转染方法之一，具有较高的转染率，优于磷酸钙法。然而，由于脂质体对细胞具有一定毒性，因此通常转染时间不超过24小时。
（图片来源于网络）
特点：脂质体转染法在细胞转染领域具有多种优势。首先，它能够高效地转染多种细胞系，使其成为适用于高通量筛选的理想选择。其次，脂质体转染法能够成功递送各种大小的DNA、RNA和蛋白质，不论是稳定表达还是瞬时表达都能够实现。另外，与其他化学方法不同的是，脂质体转染法还可以用于将DNA和RNA引入动物和人体内，拓展了其在基因治疗等领域的应用潜力。然而，值得注意的是，转染效率受到细胞类型和培养条件的影响，因此需要针对每种细胞类型进行转染条件和试剂的优化。
04实验材料、试剂、仪器
脂质体转染试剂：使用的是Promega公司的TransFast脂质体试剂，它是一种阳离子脂质体和中性脂质体的混合物，专为优化在实验中使用的293T细胞的转染效率而设计。
细胞和质粒：包括293T细胞、MyoD表达质粒、EGFP表达质粒。
培养基和试剂：DMEM培养基、青霉素、FCS、PBS、EDTA、链霉素、小牛血清。
仪器和实验工具：微量移液器、Tip头、涡旋振荡器、恒温水浴箱、台式离心机、培养皿、转染管、离心管、倒置显微镜（用于观察）、荧光显微镜（用于观察荧光标记的细胞）、CCD（用于图像捕获）。
05实验步骤
一、细胞传代
1、试验准备：200 ul/1mlTip头各一盒（以上物品均需高压灭菌），酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。
2、弃掉培养皿中的培养基，用1 ml的PBS溶液洗涤两次。
3、用Tip头加入1 ml Trypsin液，消化1分钟（37℃，5%CO2）。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。
4、加入1 ml的含血清培养基终止反应。
5、用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。
6、将培养液装入离心管中，1000 rpm离心5 min。
7、用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X106个细胞加入一个35mm培养皿。
8、将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。
9、将培养皿转入CO2培养箱中培养，第二天转染。
二、细胞转染
1. 转染试剂准备：首先，在试剂管中加入400微升去核酸酶水，进行10秒钟的震荡，以确保溶解脂状物。之后，将试剂保存在-20℃，使用前再次震荡。
2. 混合比例选择：在转染管中，按照适当的比例（1:1-1:2/脂质体体积:DNA质量），加入适量的无血清培养基，然后加入适量的MyoD或EGFP的DNA，最后加入适量的转染试剂，进行震荡混合。
3. 混合液静置：将混合液在室温放置10-15分钟，以促进有效的DNA与转染试剂的结合。
4. 培养基清洗：吸去培养板中的培养基，然后用PBS或者无血清培养基进行一次清洗，以减少转染试剂对细胞的干扰。
5. 加入混合液：将混合液加入培养皿中，然后将细胞放回培养箱中培养一个小时，以确保转染试剂与细胞充分接触。
6. 继续培养：到指定时间后，根据细胞类型决定是否移除混合液，然后加入完全培养基，继续培养24-48小时，以促进转染基因的表达和细胞的增殖。
三、第二次细胞传代
第二次细胞传代是细胞转染后的重要步骤，具体操作如下：
1. 转染后24小时内，观察和记录绿色荧光蛋白的表达情况，以评估转染效果和基因表达水平。
2. 再次进行细胞传代，以0.8X10^5个细胞/35 mm培养皿的适当密度重新悬浮并培养，确保细胞在新的培养条件下继续生长和扩增。
3. 在正常的培养条件下，培养细胞24小时，然后根据需要进行适当的固定处理，例如染色或其他实验操作。
4. 如果需要进一步优化转染条件，可以参考TransFast的使用说明书，进行相应的参数调整和优化实验。
06细胞转染注意事项
1. 培养基中的成分：转染前需使用无血清的培养基，因为血清会影响DNA-阳离子脂质体复合物的形成。尽管在转染过程中可以添加血清，但在形成复合物的过程中需保持无血清条件。
2. 抗生素的使用：抗生素可能影响转染效率，因为阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素进入细胞，降低细胞活性，从而降低转染效率。使用不含脂质体的试剂，如英格恩生物的Entranster转染试剂，可以在培养基中加入抗生素，避免细胞染菌。
3. 设置阳性和阴性对照：在转染过程中设立适当的阳性和阴性对照有助于验证转染效果。一般在转染24-48小时后，靶基因开始在细胞内表达，根据实验目的选择合适的时间进行表达检测实验。
4. 质粒DNA的纯度和质量：用于转染的质粒DNA必须无蛋白质、无RNA和其他化学物质的污染，OD260/280比值应在1.8以上，以确保最佳的转染效率和基因表达。
5. 转染细胞的密度：转染当日的细胞密度应在70-90%（贴壁细胞）或2×10^6-4×10^6细胞/ml（悬浮细胞）为宜，以确保最佳的转染效率和基因表达水平。
这些因素综合影响着转染效率和转染后的基因表达情况，对于实验结果的准确性和可重复性具有重要意义。
总结
并没有一种通用方法适用于所有细胞类型和实验需求。各种转染方法在转染效率、细胞毒性、对正常生理的影响以及基因表达水平等方面存在差异。因此，在选择转染方法时，需考虑具体的细胞类型和实验需求。理想的方法应具备高转染效率、低细胞毒性、最小程度的生理影响，易于操作且具有高重复性。此外，需要对选定的方法进行各种转染条件的优化，以建立一个稳定可靠的实验方案。
