3.疾病诊断的新兴技术

（ps：作者在这一段开始介绍本文所使用的新兴技术了，以便同之前介绍的一些“旧”技术相区别，凸显优势）近年来，循环生物标志物被广泛运用到肿瘤的筛查、肿瘤的生物基础研究以及肿瘤的复发和侵袭研究上来。但是由于血液中生物大分子种类繁多，比如有蛋白质、代谢物、miRNA等，这为血液循环生物标志物的应用带来了挑战。不过，液相色谱-质谱法（LC-MS）是一个发现新型疾病生物标志物的强有力工具！之前已经有不少研究使用了这一方法，从体液（血液和尿液）中鉴别出新型的有意义的生物标志物，用于HCC的诊断。但是，那些研究都是基于小样本的pilot研究。我们之前也进行了一些类似的研究，发现了一些生物标志物的panel，但是一是受限于样本量，二是缺乏外部验证的人群，再加上不同个体之间生物背景的异质性很大，所以，我们需要开展一个大型的多中心的研究，来发现更加稳定的生物标志物（ps：作者一方面肯定了前人的工作，这是先礼后兵，然后立马话锋一转，一个however，点出之前的研究样本量不够，都是小打小闹啦）。

4.我们干了啥

（ps：估计到了这一段，各位童鞋用膝盖也能想到作者写了啥，毫无疑问，第一点，开展了一个大型的多中心的研究，第二点，应用了powerful的LC-MS方法，目的就是发现最具有临床意义的HCC早诊生物标志物。总的来说，这样一个introduction，逻辑十分清晰，要点十分明确，作者的目的也达到了，编辑和审稿人也被他带了进去，迫不及待想知道研究的结果怎么样了……）

材料方法

1.研究设计和纳入患者

本研究共纳入了1488名研究对象，其中包括正常对照、慢性乙肝病人、肝硬化患者、HCC患者、胃癌患者（GSC）以及肝内胆管细胞癌（ICC）。研究对象来源于中国6个临床机构，纳入的时间为2008年9月至2014年5月。研究对象的排除标准为：对于正常对照，如果①肝功能不正常，②有肝病家族史以及其他系统疾病则排除；对于肝病患者，如果患有其他急性病或者其他恶性肿瘤，则排除。研究设计如下图所示：

从上图可以看出，整个研究分为三个阶段，第一阶段为“发现阶段”，共纳入了108名研究对象，目的在于发现候选的生物标志物；第二阶段为“测试阶段”，共纳入了684名研究对象，包括325名HCC患者，目的在于验证第一阶段发现的候选生物标志物；第三阶段为“验证阶段”，该阶段共纳入了两个队列，队列1观察了572个对象，用于确定最终的生物标志物panel；队列2包含84个对象，包括42例新发HCC患者，以及为这42名HCC患者挑选的 42名对照，构成了一个巢式病例对照设计，用于最终的验证。另外，值得注意的是，在第二阶段和第三阶段，作者都纳入了S-HCC，目的在于验证候选生物标志物的HCC临床早诊能力；此外，作者还纳入了胃癌和ICC患者，目的在于检验候选生物标志物的特异性。（ps：整个研究设计看着很复杂，但是很有层次，前两个阶段较容易理解，主要是第三阶段的设计，作者不仅纳入了已经明确诊断的HCC病例，还通过前瞻性的队列获得了部分HCC病例，用于候选生物标志物的验证。这种设计其实是一种非常精彩的做法。通常情况下，我们较容易获取横断面的资料，包括常见的病例对照设计，也容易获取回顾性的资料，比如回顾性的队列，作者通过容易获取的资料进行了前面的大部分“发现”工作，而验证是通过前瞻性的队列研究来实现的。在队列基线或者队列初期，作者就收集了研究对象的血液，然后进行随访观察，最终发现部分对象发展成为了HCC，这时候，在前期采集的血液就显得十分珍贵了，因为这些血液中生物标志物很有可能与最终没有发展成HCC的对象存在不同，而应用在前面的工作中已经“发现”的候选生物标志物，就可以验证它们对于HCC发生的预测功能（pre-clinical diagnosis）。此外，假如这一步无法实现，因为队列不能无止境的观察下去，我们可以在新发HCC患者确定后，采集他们的血液，与队列中的非HCC对象，进行相应的比较分析，确定候选生物标志物的诊断功能。）

2.血浆采集和质谱分析

这一部分无特别之处，大部分是代谢组的常规操作，不过Bob对此也不是很熟悉，请各位看官浏览原文，Bob在此不做讲解。唯一值得借鉴的地方是，作者人为构建了一些用于质量控制的sample，即quality control samples，具体做法是将他们实验室之前收集的很多血清混合在一起，然后构成多个QC样本，目的就在于监测后续分析的稳定性。

3.统计分析

本文的统计部分稍显复杂。作者首先对于来自不同人群（HCC患者，正常对照，肝硬化患者，还有QC样本）的血清代谢物进行了一个主成分分析，对组间整体代谢组的变化进行评价，并监测研究的稳定性。随后采用了一个偏最小二乘判别分析对不同组别进行鉴别，目的在于找到一个“分类标准”，使组间的差异最大，而组内的差异最小，并且顺便找到对于分类贡献最大的几个变量。作者随后使用了permutation test对构建的模型进行了拟合度验证，目的在于避免模型的过拟合（over fitting），而这个permutation test，其作用与bootstrap类似，有时候又被称作randomization test。

结 果

1

纳入对象的人口学信息和基本特征

2

血清生物标志物分析

下图展示了研究第一阶段数据（发现阶段）和第二阶段（测试阶段）的数据的PCA结果。

上图中，不同颜色的点代表不同的sample，其中大家注意到绿色的点，这些点是QC sample，明显可以看到这些点在A、B两张图中都聚到一起了，这表明前面的质谱实验结果是稳定可靠的。此外，我们也可以看到，不同组别的sample，其在主成分散点图上的分布是有区别的，同一类型的倾向于聚在一块。作者通过数据库的比对，最终发现了239个候选代谢物，进入下一步分析。

3

候选代谢物的确定

偏最小二乘判别分析显示不同组别之间区分明显，如下图所示：

最终作者发现了57个候选代谢物，它们对于两个主成分的贡献都大于1（VIP>1.0），然后，作者构建了一个简单的单因素回归分析，去判断这57个候选代谢物与HCC的关系是否具有统计学意义，最终17个代谢物满足条件。

作者进一步希望从候选的17个代谢物中继续筛选出最有意义的那些。而入选的标准是：1）在不同组别的比较中，比如HCC vs. 正常对照，HCC vs. S-HCC，都有显著的差异；2）在不同组别的比较中，保持相同的变化趋势，比如在HCC vs. 正常对照中，A代谢物表现为上升，那么在其他组的比较中，也应该表现为上升。最终作者选出了8种符合上述条件的代谢物。然后，作者又构建了一个logistic回归模型，并采用逐步回归的方式，从8种代谢物中最终挑选了2种出来，获得最后的胜利！它们分别是Phe-Trp（苯丙酰胺-色氨酸）和GCA（甘胺胆酸盐）。

下图展示了这两种代谢物在不同组别样本中的血清浓度。*表示与正常对照比较，＃表示与HCC患者比较。

作者然后比较了这两种代谢物与常规的AFP相比，诊断的准确性更高，具体表现为AUC曲线下的面积更大。

4

代谢物诊断准确性验证

上图展示的是在三个不同阶段，AFP、两个代谢物以及二者联合的肝病诊断准确率。其中AFP+表示患者AFP浓度大于20 ng/ml，AFP-表示浓度低于20 ng/ml。此外，作者利用验证阶段的cohort2，检验了HCC诊断前的不同时间内，代谢物和AFP的预测能力。如下表所示：

从上表可以看出，越接近于HCC的临床诊断时间，代谢物和AFP的预测能力越强，这一点显然是符合逻辑的。

在结果的最后部分，作者研究了代谢物与患者的肝功能指标之间的关系。

热图表示的是不同的代谢物浓度与患者肝功能指标的相关性（以相关系数表示）。图B和C展示的是在不同的组织中，两种代谢物的浓度，DNT表示远处的非癌组织，ANT表示癌旁组织，HCT表示癌症组织。在不同组织中，都可以发现两种代谢物的浓度差异！

总 结

本文是一个非常全面和严谨的临床代谢物研究，其中涉及的实验方法、统计学方法都值得我们学习。作者在行文过程中，像侦探破案一般，一层一层抽丝剥茧，最终找到了两个有意义的血清生物标志物，并在此基础上，从不同的角度对它们进行了验证。此外，本文是基于6个临床中心开展的临床研究，涉及discovery set，test set，以及validation set，既有内部验证，又有外部验证，关键是还有队列验证，值得我们借鉴！

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