铁死亡（Ferroptosis）是一种铁依赖的非凋亡形式的细胞死亡，其发生与细胞内氧化应激失衡以及抗氧化防御途径受损密切相关。随着研究的深入，学界逐渐认识到蛋白质相互作用在铁死亡调控中扮演着关键角色。铁死亡作为一种新型的细胞死亡形式，其调控机制极为复杂且呈现多样化。深入理解铁死亡相关蛋白的相互作用网络，对于阐明其发生机制以及寻找潜在的治疗靶点具有极为重要的意义。BioID作为一种新兴的蛋白质相互作用鉴定技术，为研究细胞内蛋白质相互作用开辟了新的途径，在研究铁死亡相关蛋白网络方面展现出巨大的潜力。本文以Caspase-2在铁死亡中的作用研究为例，深入探讨BioID技术在揭示铁死亡机制中的具体应用及重要发现，有望为铁死亡研究领域带来新的突破。

一、BioID技术简介

BioID技术基于邻近依赖的生物素标记原理，通过将目标蛋白与生物素连接酶BirA*融合表达，使目标蛋白周围的蛋白质被生物素标记，进而通过亲和纯化和质谱分析鉴定出与目标蛋白相互作用的蛋白质。该技术具有能够在活细胞内接近生理条件下进行实验、捕获瞬时或弱相互作用等优势。

BioID技术原理图

二、BioID在Caspase-2与铁死亡研究中的应用

在一篇以Caspase-2为研究对象的铁死亡机制研究中，BioID技术发挥了关键作用，为了探究Caspase-2在铁死亡中的作用机制，该研究采用了BioID技术鉴定与Caspase-2相互作用的蛋白质网络。在研究中，首先将Caspase-2的催化活性位点突变体（Casp2C320G）与BirA连接酶融合，构建BirA-Casp2C320G表达载体，并转染至H1299p53R273H-Casp2−/−细胞中。在细胞培养过程中加入生物素，使BirA*-Casp2C320G能够在其周围约10纳米范围内的蛋白质上添加生物素标签，随后利用streptavidin agarose beads捕获被生物素标记的蛋白，并通过质谱分析鉴定出与Caspase-2相互作用的蛋白质。

（一）实验方法

1.构建诱饵蛋白融合载体：构建BirA*-Casp2C320G表达载体。

2.细胞转染与处理：将上述载体转染至H1299p53R273H-Casp2−/−细胞中，并在含有生物素的培养基中孵育，部分实验中加入铁死亡诱导剂Erastin。

3.生物素标记蛋白的捕获：裂解细胞后，利用 streptavidin agarose beads 捕获被生物素标记的蛋白。

4.质谱分析：对捕获的蛋白进行质谱分析，鉴定与Caspase-2相互作用的蛋白质。

（二）实验结果

1.鉴定相互作用蛋白：在基础状态和Erastin处理条件下分别鉴定了25和17个与Caspase-2相互作用的候选蛋白，其中包括热休克蛋白（如Hsp70家族成员）、辅助分子伴侣（如DNAJB1、BAG3等）以及突变型p53蛋白。

2.功能富集分析：利用STRING数据库对相互作用蛋白进行功能富集分析，发现这些蛋白主要参与蛋白质折叠与稳定性、细胞应激响应等生物学过程。

3.验证相互作用：通过免疫共沉淀实验验证了Caspase-2与突变型p53的直接相互作用。

BioID实验结果分析图

三、总结

BioID技术的应用为铁死亡机制研究提供了新的视角和方法。其优势在于能够在活细胞内接近生理条件的环境中进行蛋白质相互作用的研究，避免了传统共免疫沉淀等方法对蛋白互作可能产生的干扰。此外，BioID技术特别适合于捕捉那些瞬时或弱的蛋白质相互作用，这对于理解铁死亡相关蛋白在复杂细胞环境中的动态功能至关重要。

BioID技术在研究Caspase-2与铁死亡机制中的应用，不仅成功鉴定了Caspase-2在突变型p53癌细胞中的相互作用蛋白网络，还为深入理解Caspase-2在铁死亡中的作用机制提供了关键信息。随着BioID技术的不断发展和完善，其在铁死亡及其他细胞死亡机制研究中的应用前景将更加广阔。