1.1 配制微生物培养基

配制培养基的基础知识是培养、观察和研究微生物的基础。教学时，可先展示有菌落生长的培养基平板，给学生以视觉刺激，让他们体会到要观察和研究微生物，必须创设一定的条件让微生物大量快速繁殖，只有形成有一定特征的菌落，才能更好地研究微生物。教师向学生提供几种微生物培养基的配方，让学生通过比较分析各种配养基配方，明确微生物培养基的基本成分包括: 碳源、氮源、无机盐和水，有些微生物还需要某些特殊的生长因子。然后，依次阐明固体、半固体和液体培养基的用途和配制方法，并结合下面的流程图概述培养基配制的操作步骤（图2）：

图2 配制培养基的操作步骤

组织学生配制微生物培养基时，要讲清下列注意事项：

①溶化琼脂时要控制火力的大小并不断搅拌，以免培养基溢出或烧焦。

②加热过程中部分水分蒸发，待琼脂完全溶化后应补加蒸馏水，以保持溶液的浓度。

③分装至试管时培养基的高度不要超过试管高度的1/5。

④ 一般是培养基先灭菌再倒平板，也可先倒平板，课间再灭菌。

⑤冷却后的平板要倒置，以确保拿放方便，同时避免水分蒸发，以利于微生物生长。

1.2 无菌技术操作

无菌技术是培养、分离和纯化微生物的重要技术手段，也是植物组织培养的关键性操作。教学时，先让学生正确区分消毒和灭菌这2个概念，并充分认识无菌操作的重要性; 然后，在教师的组织和指导下进行规范、熟练的操作，以便顺利完成微生物的培养、分离和纯化等实验。表1是消毒和灭菌的一些常用方法及使用范围。

表1 消毒和灭菌的常用方法及使用范围

接种的方法及作用

微生物接种方法有2种：

①划线接种，即用接种环划线将菌体沾在斜面培养基或平板培养基上。微生物的生长和繁殖迅速，一段时间后，就会在培养基表面形成长满菌落的细线。划线法的作用是纯化微生物，通过划线将微生物单个地分离，并最终形成标准的菌落。

②涂布接种，即用涂布器将稀释菌液均匀地涂布在平板上。一个菌体在培养基平板上形成一个菌落，通过统计菌落数可计算样品中的菌体数目。

规范实验操作

接种过程的无菌操作是微生物实验的关键环节，图3为划线接种的操作示意图，表2列出划线接种的基本步骤和说明。教学中，要求学生认真领会无菌接种的技术原理和反复练习操作步骤。通过练习达到熟练程度，并培养严谨认真的科学精神和一丝不苟的实验态度。

图3 划线接种操作示意图

表2 划线接种的操作步骤和说明

序列	操作步骤	分析说明
1	将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红	将接种环灭菌，避免污染菌种
2	在火焰旁冷却接种环，拔除盛有菌液的试管棉塞	避免杂菌污染菌种
3	将试管口通过火焰	灼烧灭菌，防止试管口菌体污染培养基
4	将已冷却的接种环伸入菌液中，沾取菌液	冷却接种环可避免杀死菌种
5	将试管口通过火焰，并塞上棉塞	避免试管口杂菌污染菌种
6	左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基	初步接种。划破培养基不利于后续的继续划线，长出的菌落不标准
7	灼烧接种环，冷却后从第一区划线的末端向第二区划线。重复以上操作，在第三、四、五区划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连	从上个区域的末端向下个区域划线,可逐步分离出单个菌体，从而实现微生物的纯化
8	将平板倒置，放入培养箱中培养	倒置平板防止水分蒸发，也方便拿放

1.3 稀释菌液的意义和操作方法

在单位体积的菌体培养液内，含有的微生物个体数目很多。要对微生物进行分离和计数必须将菌液稀释，只有在稀释度足够高的菌液里，聚集的微生物才能分散成单个细胞。一般将菌液稀释到

时，接种后可在培养基平板上形成30~300个左右的菌落，统计的菌落数也比较准确可信。

用移液管和无菌水稀释微生物菌液是要求较高的操作技术，学生需经过多次练习才能做到尽量减少误差。以土壤为样品进行稀释操作时需注意以下事项：

①初次称量的土壤样品，稀释后的菌液浓度较大，移液时极易堵塞移液管或吸入较多的土壤颗粒，应静置一段时间后再移液，或用低速离心机离心1 min后进行移液。

②当稀释倍数较大时，在稀释前一定要震荡试管，充分混合菌液，保证移液操作的准确性。

③每次移液前一定要注意用无菌水（或蒸馏水）清洗移液管并用气球吹干，以保证移液的浓度与试管中的一致。

2 实验设计能力的训练

2.1 选择性培养基的实验设计

根据功能的不同，培养基分为选择性培养基和鉴别性培养基。在“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”的实验中，先让学生通过分析和判断3个培养基配方（图4），真正理解选择性培养基的含义。然后，启发学生设计一组用于分离尿素细菌的探究实验，帮助学生理解选择性培养基的特性及作用，如表3。

图4 不同培养基配方

表3

2.2 鉴别性培养基的实验设计

在“分解纤维素的微生物的分离”实验中，要鉴别经筛选的微生物是否为分解纤维素的微生物，必须用鉴别性培养基。刚果红与纤维素等多糖类物质反应形成红色复合物，添加刚果红的培养基呈红色，接种的微生物若能分解纤维素，则会在其菌落的周围形成透明圈。值得注意的是，培养基的琼脂中含有淀粉类物质，产生淀粉酶的微生物在培养基上也会形成透明圈；也有些微生物具有降解刚果红的能力，培养时间过长，也会在菌落周围出现透明圈。与分解纤维素形成的透明圈相比，这2种透明圈小而模糊，因此，本实验最好先用选择性培养基筛选分解纤维素的微生物，再配制鉴别性培养基进行“分解纤维素的微生物的分离”的实验。

3 教学实施的前期准备

3.1 提前准备好仪器、设备和药品

为方便大家提前做好准备，现以人教版教材为例，将本专题所需要的仪器、设备和药品列表如表4。

表4 “微生物的利用”专题所需仪器、设备及药品

课题名称	实验仪器和设备	实验试剂或药品	说明
微生物的实验室培养	培养皿、试管、锥形瓶、量筒、酒精灯、电子天秤、高压蒸汽灭菌锅、移液管、接种环、涂布器、恒温箱、干热灭菌箱、小铁铲等	牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、盐酸、氢氧化钠、琼脂等	干热灭菌箱能够迅速地将洗干净的培养皿和试管烘干，小铁铲用于铲土
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数	除配制牛肉膏蛋白胨培养基所需物质外，增加KH2PO4、NaHPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、尿素、酚红等
分解纤维素的微生物的分离	除配制牛肉膏蛋白胨培养基所需物质外，增加纤维素、NaNO3、Na2HPO4·7H2O、KH2PO4、KCl、酵母膏、水解酪素、CMC-Na(羧甲基纤维素钠)、土豆汁、刚果红等

3.2 做好课时安排及计划

表5为本专题的3个课题的课时数及其说明。

表5 “微生物的利用“专题课时数及说明

3.3 安排好教学班的实验顺序

微生物实验涉及较多的实验仪器，且实验时需要课、外相结合，例如实验室培养需要学生在课堂上完成2项重要的操作步骤，①配制培养基并倒平板；②接种操作。平板灭菌工作因需时较长，可由教师在课间完成。为保证每位学生都能亲手操作，保证各个教学班能在有限时间内完成实验任务，教师可采取如图5所示的教学流程和教学安排。

图5 教学流程和教学安排

3.4 做好课后的观察与记录

配制培养基和接种操作可在课堂上完成，但接种后的平板放入培养箱中需要培养2~3d，这期间可安排生物学课代表或部分小组长进行定期观察，并做好记录，以便及时让其他学生观察到自己的实验成果。特别需要说明的是，如果学生不能及时观察，培养时间过长，很多菌落会联成一片，计数时则无法做到准确有效。

4 实验中需要注意的安全操作

微生物本身就是危险生物，实验操作中又涉及消毒、灭菌和接种等基本环节，因此要对学生进行安全教育，确保学生的安全和实验的顺利进行。

①确保操作安全。接种时要注意避免手被酒精灯火焰灼伤，接种后要及时提醒学生洗手，以防止被微生物感染。

②确保环境安全，使用后的培养基丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境。

文章来源：吴成军.“生物技术实践”教学研讨：“微生物的利用”的教学组织.生物学通报，2008，43（10）：28.

本文转自《生物学通报》微信公众号